Bioxy新型过乙酸消毒剂对细小病毒的抗病毒活性研究

众所周知,猪细小病毒(PPV)对用于控制其他非包膜病毒的消毒剂具有特别的耐药性。然而, 用于对抗PPV 的有效消毒剂对动物卫生设施和环境都具有很强的刺激性和腐蚀性。我们提出一种无腐蚀性的“绿色”消毒剂Bioxy,它能够原位生成过氧乙酸,并能够在1%的浓度下完全灭活PPV,接触时间为10 分钟。

在感染性病原体、易感宿主和环境(水、食物、污染表面、气溶胶)的三元组中,后者在传染病传播中的作用最不明确。病毒可能大量进入环境,阻止或减少传播的环境措施可能为疾病控制提供巨大的前景。来自太阳的紫外线(UV)辐射,若未经屏蔽,则成为环境中的主要杀菌剂(1)。几乎所有的人工病毒灭活方法都是在实验室或医院中在受控条件(2,3)下局部应用的,因为抑制剂的使用条件是严苛的,或不能大范围应用。Weber 和Stlianakis(4)以及Vinnerås 等人(5)报告并审查了值得注意的例外情况。Vinners 等人(5)报道了将甲酸添加到地面高危动物副产品(ABP 1)中,在稳定性和病原体灭活方面的效果。尽管预期甲酸与单链DNA 基因组发生强烈的反应,但猪细小病毒(PPV)在168 天后仍然处于完全感染的状态。

细小病毒可以抵抗恶劣的环境条件(3),并且当他们在表面存活很长时间后能够传播给易感宿主。除化学杀菌剂外,通常还使用加热和辐射的方式。猪细小病毒已知具有特别的耐药性,因为通常被认为对其他非包膜病毒有效且用于高水平消毒的许多杀生物剂具有有限的灭活潜力。对于其他病毒种类的灭活研究,它是一种特别具有抗性的替代物。

基于戊二醛类的消毒剂不仅用于动物卫生的农业设施,而且还用于医院和人类安全的医疗保健机构,用于消毒表面和柔性内窥镜等仪器(6,7)。然而,由于高达15%的英国医院将其作为首选内窥镜消毒剂,并且戊二醛会对工作人员造成职业健康的危害或风险,因此需要一种更安全的替代品,以降低潜在的健康、安全和环境风险(8,9)。

2%戊二醛一直是高级消毒的参考消毒剂,但它经常出现的副作用促使人们寻找新的消毒剂。当将2%戊二醛的效力与0.2%过氧乙酸基消毒剂进行比较时,两种产品在10 至20分钟内均表现为有效的杀菌剂;然而,当添加有机物时,0.2%的过乙酸溶液配方清洁且无腐蚀,而2%的戊二醛将物质残留在手术刀上,并在2 h 内引起腐蚀(10)。此外,2%戊二醛的PPV 灭活结果也是矛盾的(3,11)。由于土壤等有机物的存在,醛的固定特性可能会降低。

除戊二醛外,氯化物(次氯酸钠和二氧化氯)、过氧化氢和过氧乙酸等氧化剂也被广泛用作高级消毒剂,对各种工业内用于对表面、设备和仪器进行消毒(12-15)。尽管它们在控制病原体方面是有效的,但它们对使用者具有刺激性(16),对表面具有腐蚀性,(17)并且不像氯基消毒剂那样利于环保(18)。

在本研究中,我们对一种获得专利的绿色灭活剂在环境中灭活或减轻PPV 的能力进行了评估。首先,开发了一种针对病毒相对感染性的敏感方法,然后对其疗效进行评估。

使用Bioxy进行消毒

源自ST 细胞(ATCC CRL-1746)的猪睾丸(PT)成纤维细胞在含有D-葡萄糖和L-谷氨酰胺的Dulbecco 改良Eagle 培养基(Wisent,Saint-Bruno,魁北克,加拿大)中于37℃生长,并配以用7%热灭活的牛血清(Wisent)和抗生素青霉素-链霉素溶液(Wisent)。通过在PT细胞培养物中繁殖获得猪细小病毒(PPV,NADL-2 株)原种。通过短暂离心收集病毒原液以除去细胞碎片。

通过简单地将病毒原种与生物氧环境或生物氧+溶液(Bioxy AFD,蒙特利尔,魁北克,加拿大)混合来进行病毒灭活。在生物氧环境或生物氧+溶液孵育后,将病毒种群与等量的氯仿-丁醇(1:1)充分混合。然后用离心机以每分钟10 000 转的速度回收病毒,如前所述(19)。根据制造商的说明,将产生的水相收集并装入离心微孔过滤装置(Millipore, Etobicoke,安大略,加拿大),以去除剩余的生物氧环境或生物氧+化合物。然后用等体积的1*磷酸盐缓冲盐水(PBS)将过滤器保留的病毒悬浮起来进行滴定。

如前所述,用免疫荧光法(IF)测定病毒滴度(20)。简言之,将细胞以每孔1×104 的比例接种在96 孔板中。24 小时后,细胞被感染。细胞感染后20 小时,将感染的细胞进行IF 测定。用3%甲醛溶液将细胞固定至少30 分钟,然后用3% Triton X-100 渗透30 分钟,再用单克隆小鼠衣壳特异性抗体(3C9-D11-H11)与抗小鼠Alexa Fluor 488 作为次级抗体(ThermoFischer Scientific, 加拿大)进行孵育。然后对荧光核进行评分, 用荧光聚焦形成单位/mL(FFU/mL)表示病毒滴度。

首先,用1%、0.5%和0.1%的生物氧环境或生物氧+处理PPV 病毒原液10 分钟。实验重复3 次。结果发现,1%的生物氧环境或生物氧+能有效灭活病毒,0.5%或0.1%的生物氧环境或生物氧+能部分灭活病毒(图1)。此外,该浓度的生物氧环境或生物氧+不影响PT 细胞的活力。用生物氧环境或生物氧+处理的细胞未检测到荧光信号(数据未显示)。

图1 猪细小病毒被生物氧环境或生物氧+灭活。用1%、0.5%或0.1%的生物氧环境(A)或生物氧+ (B) 孵育PPV 病毒原液10 分钟。重复实验后的结果如下。

图1

其次,为了评估生物氧环境或生物氧+在60 分钟内灭活病毒的能力,将PPV 病毒原种与0.1%的生物氧环境或生物氧+一起分别孵育10、20、30、40、50 和60 分钟后,测定病毒滴度。该实验重复3 次。在培养10 分钟后,病毒滴度没有显著降低,并且即使在60 分钟后,病毒仍然具有传染性(图2)。这表明病毒的灭活与浓度有关。

1%生物氧环境或生物氧+可以完全灭活PPV 10 分钟的时间;然而,PPV 灭活浓度依赖于生物氧环境或生物氧+在1%浓度下显示的最佳活性。

图2 猪细小病毒的灭活与浓度有关。将PPV 病毒原种与0.1%的生物氧环境或生物氧+一起分别孵育10 、20 、30 、40 、50 和60 分钟。重复实验后的结果如下。

图2

致谢
这项研究得到了美国国家科学与工程研究委员会和原子基金会(加拿大魁北克蒙特利尔)的支持。

参考文献

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